His標簽（多組氨酸標簽）是在變性條件下純化重組蛋白的常用方案。His標簽蛋白純化技術(shù)因其標簽分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且對目標蛋白功能、活性及構(gòu)象干擾極小等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)通過基因工程手段在目標蛋白N端融合6個連續(xù)組氨酸殘基（6×His），基于固定化金屬離子親和層析（IMAC）原理，使His標簽與固定化鎳/鈷離子通過穩(wěn)定的配位鍵特異性結(jié)合。

固定化金屬離子親和層析（IMAC）是純化組氨酸標簽蛋白的常規(guī)方法。該方法采用含有固定化金屬離子（如鈷離子，Co2?）的IMAC介質(zhì)，通過金屬離子與His標簽的配位結(jié)合實現(xiàn)目的蛋白的捕獲。將介質(zhì)裝填至層析柱后，以低咪唑濃度緩沖液作為上樣緩沖液攜帶目標蛋白。控制緩沖液以低流速緩慢流經(jīng)層析柱，使His標簽蛋白與介質(zhì)中的Co2?充分結(jié)合。然后采用高咪唑濃度緩沖液通過競爭性置換將目的蛋白洗脫回收。

這種方法通過在固定化金屬離子親和層析柱（IMAC column）中精確控制變性緩沖液（如含咪唑溶液）的體積與流速，可實現(xiàn)組氨酸標簽蛋白的穩(wěn)定純化。純化過程的控制越精確，目標蛋白在單次柱上操作中的回收率越高。采用可控且可重復(fù)的IMAC純化流程，研究人員可在最短時間內(nèi)獲得高純度、高活性的目標蛋白。

應(yīng)用于His標簽高效蛋白純化的理想注射泵解決方案

許多實驗室致力于尋找一種經(jīng)濟高效的方法以實現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)純化。一種便捷的方案是通過鈷重力柱以精確可控的方式輸送雙路獨立的咪唑緩沖液進行可控洗脫，從而實現(xiàn)對His標簽蛋白的高效純化。針對該應(yīng)用的理想注射泵解決方案是通過I/O端口及內(nèi)置的編程功能，將兩臺 Harvard Pump 11 Elite 可編程注射泵進行聯(lián)用。此配置可構(gòu)建創(chuàng)新性的注射泵系統(tǒng)，實現(xiàn)對兩臺注射泵獨立流速的同步控制。利用內(nèi)置的多步驟編程及輸入/輸出信號通信功能，所有操作均可通過Pump 11 Elite的觸控界面完成，無需外部編程或計算機支持（見圖1）。

圖1

注射泵A：控制一支 10 mL 氣密型注射器，用于將含有His標簽蛋白的低咪唑濃度緩沖液以 1 mL/min 的流速注入重力柱，總體積為10 mL，持續(xù)10分鐘。精確控制流速對于確保His標簽蛋白與柱內(nèi)鈷基IMAC介質(zhì)充分結(jié)合至關(guān)重要。 

注射泵 B：控制一支 10 mL 氣密型注射器，用于輸送高咪唑濃度緩沖液，用以將結(jié)合在鈷基親和層析介質(zhì)上的標簽蛋白洗脫下來。

下一步操作要求 注射泵 A 進入回抽模式以完成灌注。注射泵 A 向注射泵 B 發(fā)送信號，讓注射泵 B 通過其注射器吸入高咪唑濃度緩沖液。從注射模式切換至回抽模式所產(chǎn)生的壓力變化將觸發(fā)單向閥開啟，從而使兩臺泵均能充滿合適濃度的咪唑緩沖液。回抽過程需迅速但可控，以避免緩沖液發(fā)生脫氣現(xiàn)象。緩沖液一旦脫氣，將對重力柱中鈷基介質(zhì)上的蛋白純化反應(yīng)產(chǎn)生不利影響。

當兩個注射器均完成裝填后，注射泵A 和 注射泵B 將同時按照預(yù)設(shè)的流量程序運行：

注射泵A：輸送低咪唑濃度緩沖液，初始流速為 1mL/min，經(jīng)20分鐘后遞減至0 ml/min（見圖2）。

注射泵B：輸送高咪唑濃度緩沖液，初始流速為 0mL/min，經(jīng)20分鐘后遞增至1mL/min（見圖3）。

圖2 (左)  & 圖3 (右)

通過雙泵協(xié)同控制，鈷重力柱內(nèi)的總流速在梯度運行期間始終維持在1mL/min，這樣的流速既能保證標簽蛋白的有效洗脫，又可避免對重力柱超壓（見圖4）。

圖4