服務(wù)熱線
86-021-52261560
Product classification
01. 什么是通用型iPSCs？
通用型誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）是指經(jīng)過基因編輯處理，能夠降低免疫原性、避免免疫識別與攻擊，從而可適用于異體移植的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。此類細(xì)胞在異體移植場景中不會引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，具有“現(xiàn)成"可用、經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)，能夠?yàn)榇笠?guī)模臨床應(yīng)用提供適合的細(xì)胞來源，推動再生醫(yī)學(xué)及基因治療技術(shù)的發(fā)展。
人類白細(xì)胞抗原（HLA）是細(xì)胞表面的關(guān)鍵分子，免疫系統(tǒng)通過其來區(qū)分自身和非自身細(xì)胞。在異體移植中，供體與受者的HLA不匹配會引發(fā)免疫排斥反應(yīng)。通用型iPSCs的構(gòu)建需要對HLA分子進(jìn)行基因編輯，以減少或消除HLA的表達(dá)，從而避免免疫系統(tǒng)的識別與攻擊。然而，HLA分子分為I類和II類，占據(jù)基因組的較大區(qū)域，難以通過單一基因編輯策略刪除。研究發(fā)現(xiàn)，敲除β?微球蛋白（β?M）亞基可以有效抑制HLA-I類分子的表達(dá)2，而敲除CIITA轉(zhuǎn)錄因子能夠抑制HLA-II類分子的表達(dá)3。通過聯(lián)合敲除這兩種基因，可以實(shí)現(xiàn)iPSCs中HLA分子的全面抑制。
然而，HLA-I類分子的缺失會導(dǎo)致自然殺傷（NK）細(xì)胞的攻擊性顯著增強(qiáng)，因?yàn)镹K細(xì)胞通過識別HLA-I類分子上的特定配體來判斷細(xì)胞是否正常。為了逃逸NK細(xì)胞的攻擊，部分研究嘗試僅保留HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G等亞類分子4,5，但這樣的iPSCs仍然無法避免免疫排斥反應(yīng)，僅能視為“半通用"細(xì)胞。因此，構(gòu)建通用型iPSCs的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于有效地防止NK細(xì)胞的攻擊1。近期的研究進(jìn)展表明，通過抑制NK細(xì)胞激活受體（KAR）的配體表達(dá)，例如敲除CD155基因并保留HLA-E分子，可以使iPSCs在逃逸NK細(xì)胞識別的同時(shí)，仍然保留對腫瘤細(xì)胞的抑制能力6。然而，NK細(xì)胞通過多種KAR與不同的配體結(jié)合，且配體表達(dá)水平會因細(xì)胞類型而異，這增加了通用型iPSCs構(gòu)建的復(fù)雜性。
02. 蛋白表達(dá)篩選驗(yàn)證基因敲除或敲低的蛋白編碼序列
流式細(xì)胞術(shù)和ELISA在檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白時(shí)存在局限性，傳統(tǒng)Western Blot耗時(shí)且重復(fù)性差。相比之下，Simple Western技術(shù)的Jess平臺能高效檢測膜結(jié)合蛋白及細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)蛋白，僅需3 µL iPSCs裂解液即可實(shí)現(xiàn)可重復(fù)定量分析，并可用于篩選殘留Cas9蛋白，保障工程化iPSCs的安全性。
SW 篩選iPSCs中的HLA以及KAR配體敲除：
利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建了靶向 HLA和KAR配體的基因敲除文庫（表1）。
表 1 iPSCs 中的基因敲低靶標(biāo)。β?M和CIITA敲除分別抑制HLA-1和HLA-2；BAT3、CD155和MICA為已知KAR配體。CIITA和BAT3為胞內(nèi)定位，其余為表面暴露靶點(diǎn)。
利用SW檢測篩選文庫中的β?M和CIITA低表達(dá)的克隆（分別抑制HLA-1和HLA-2）（圖1左）。使用RePlex™模塊通過NIR熒光通道在第二輪檢測總蛋白（圖1右）。類似方法用于篩選KAR配體表達(dá)（圖2）。
圖 1 Simple Western 篩選 iPSCs 中的 HLA 敲除。RePlex™ 模塊用于在探針 1（左）中同時(shí)檢測 β2M 和 CIITA，在探針 2（右）中通過 NIR 檢測總蛋白。
圖 2 Simple Western 篩選KAR配體敲除iPSCs克隆。RePlex™ 模塊用于在探針 1（左）中同時(shí)檢測 BAT3、CD155 和 MICA，在探針 2（右）中通過化學(xué)發(fā)光檢測總蛋白。
圖3 顯示的是以野生型為對照，量化各克隆的敲低百分比，并將流式與Simple Western 進(jìn)行對比。
圖 3 通過流式及Simple Western敲低靶蛋白的數(shù)據(jù)對比。數(shù)值表示相對于野生型對照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量為100%，敲低為0%）。靶點(diǎn)CIITA和BAT3未在流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)中展示， 可能是由于它們的細(xì)胞內(nèi)定位導(dǎo)致流式檢測結(jié)果不可靠。CIITA和BAT3的敲低百分比量化數(shù)據(jù)改在表4中呈現(xiàn)。
Simple Western顯示多數(shù)克隆的靶點(diǎn)敲低率高于流式（圖3，表2）。克隆#7對5個(gè)靶點(diǎn)的敲低具有良好效果（除BAT3為69%外，其余均低于野生型50%）。
表 2 Knockdown of intracellular targets that were unreliably detected by flow cytometry were measured by the Simple Western platform. 數(shù)值表示相對于野生型對照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量設(shè)為100%，敲低為0%）
03. 殘留Cas9篩選
CRISPR-Cas9工程化iPSCs需監(jiān)測殘留Cas9，Simple Western檢測顯示所有克隆的Cas9均低于6.4 ng/mL重組對照（圖4）
圖 4 Simple Western 篩選工程 iPSCs 中的殘留 Cas9
經(jīng)基因改造成為通用低免疫原性供體的iPSCs需在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行功能驗(yàn)證。在此環(huán)節(jié)中，Simple Western技術(shù)相比于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析方法，在以下幾個(gè)方面展現(xiàn)出它的優(yōu)勢：
(1) Simple Western儀器可無差別檢測全細(xì)胞裂解液、表面蛋白及純化蛋白，全程僅需3小時(shí)且無需人工操作。
(2) 傳統(tǒng)Western blot方法可輕松轉(zhuǎn)移至Simple Western平臺。作為毛細(xì)管電泳免疫分析，其提供尺寸特異性及抗體靶向檢測，已驗(yàn)證抗體超5,000種。
(3) Simple Western檢測僅需 3 μL 微量樣本, 無需延長細(xì)胞培養(yǎng)。
(4) Simple Western具有高重復(fù)性、高靈敏度及定量分析功能。作為開放式毛細(xì)管Western blot技術(shù)平臺，Simple Western用戶可自由選用任何商業(yè)化或定制抗體，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)蛋白及其異構(gòu)體的特異性檢測。
* 參考文獻(xiàn):
1. Koga K, Wang B, Kaneko S. Current status and future perspectives of HLA-edited induced pluripotent stem cells. Inflamm Regen. 2020 Oct 1;40:23.
2. Riolobos L, Hirata RK, Turtle CJ, Wang PR, Gornalusse GG, Zavajlevski M, Riddell SR, Russell DW. HLA engineering of human pluripotent stem cells. Mol Ther. 2013;21(6):1232–1241.
3. DeSandro A, Nagarajan UM, Boss JM. The bare lymphocyte syndrome: molecular clues to the transcriptional regulation of major histocompatibility complex class II genes. Am J Hum Genet. 1999;65(2):279–286.
4. Xu H, Wang B, Ono M, Kagita A, Fujii K, Sasakawa N, Ueda T, Gee P, Nishikawa M, Nomura M, Kitaoka F, Takahashi T, Okita K, Yoshida Y, Kaneko S, Hotta A. Targeted Disruption of HLA Genes via CRISPR-Cas9 Generates iPSCs with Enhanced Immune Compatibility. Cell Stem Cell. 2019 Apr 4;24(4):566-578.e7.
5. Kitano Y, Nishimura S, Kato TM, Ueda A, Takigawa K, Umekage M, Nomura M, Kawakami A, Ogawa H, Xu H, Hotta A, Takasu N, Tsukahara M. Generation of hypoimmunogenic induced pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 system and detailed evaluation for clinical application. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022 May 29;26:15-25.
* 本文轉(zhuǎn)載自「ProteinSimple」微信公眾號
▍關(guān)于ProteinSimple：
ProteinSimple 是美國納斯達(dá)克上市公司Bio-Techne集團(tuán) (NASDAQ:TECH) 旗下的蛋白質(zhì)分析品牌。“使蛋白質(zhì)分析更簡單"是ProteinSimple 一直以來的愿景。ProteinSimple長期致力于研發(fā)和生產(chǎn)更精準(zhǔn)、更快速、更靈敏的創(chuàng)新性蛋白質(zhì)分析工具，包括蛋白質(zhì)電荷表征、蛋白質(zhì)純度分析、蛋白質(zhì)翻譯后修飾定量檢測、蛋白質(zhì)免疫檢測技術(shù)如數(shù)字Western Blot和高靈敏微流控多重ELISA，以幫助生物制藥、細(xì)胞與基因治療、生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域科學(xué)家解決蛋白質(zhì)分析問題，加速藥物研發(fā)效率，深度解析蛋白質(zhì)和疾病的關(guān)系。作為ProteinSimple華東大區(qū) (江、浙、滬、皖、山東) 的授權(quán)代理商，上海昊擴(kuò)將為大家提供ProteinSimple旗下儀器設(shè)備。
▍關(guān)于上海昊擴(kuò)：
上海昊擴(kuò)科學(xué)器材有限公司成立于2019年，總部位于上海，是一家實(shí)驗(yàn)室設(shè)備/耗材及分析儀器的專業(yè)服務(wù)商。公司致力于為生物、醫(yī)藥、物性檢測、化工分析、食品、工業(yè)生產(chǎn)等相關(guān)領(lǐng)域客戶提供國內(nèi)外高科技專業(yè)設(shè)備以及技術(shù)咨詢服務(wù)。
Copyright © 2025 版權(quán)所有：上海昊擴(kuò)科學(xué)器材有限公司 ICP備案號:滬ICP備20016915號-1 管理登陸 技術(shù)支持：化工儀器網(wǎng) 總流量：214191 網(wǎng)站地圖